Malattie del tessuto connettivo
Lupus Eritematoso Sistemico
Vasculiti
Artrite reumatoide
Sindorme da antifosfolipidi


Malattie del tessuto connettivo
Reumatologia1
Informazioni cliniche: le malattie del tessuto connettivo (CTD) sono malattie reumatiche e comprendono il lupus eritematoso sistemico (vedi il capitolo LES), la sclerosi sistematica progressiva, la sindrome di Sjögren, le miositi e la sindrome di Sharp.

Gli autoanticorpi i cui antigeni target si trovano nel nucleo (anticorpi anti-nucleo, ANA) sono importanti marker sierologici per le CTD. Gli antigeni target includono gli acidi nucleici, le proteine nucleari e quelle ribonucleari.

La prevalenza degli anticorpi anti-nucleo nelle malattie reumatiche infiammatorie è compresa tra il 20 e il 100% dei pazienti. Di conseguenza, una diagnostica differenziale degli ANA è indispensabile per la diagnosi delle diverse malattie reumatiche e della loro differenziazione da altre malattie autoimmuni.

Diagnostica: il gold standard per la determinazione degli ANA è il test in immunofluorescenza indiretta (IFA) con cellule epiteliali umane (HEp-2), che conferisce alta sensibilità e specificità.
I campioni positivi e negativi producono una grande differenza di segnale. Nella valutazione microscopica uno specifico pattern fluoroscopico è prodotto per ogni autoanticorpo, in base alla posizione dei diversi auto antigeni.

Nel caso di un risultato positivo, i diversi substrati con lo specifico antigene (ELISA, Westernblot, Immunoblot) sono utilizzati per la differenziazione finale. L’uso esclusivo di questi test monospecifici è insufficiente per la determinazione degli autoanticorpi anti-nucleo, poichè non tutti gli antigeni pertinenti sono finora disponibili in una forma purificata. Quindi, l’ANA corrispondente può essere individuato soltanto in immunofluorescenza (IFA).
RNP SM 1
OVERVIEW PRODOTTI
Torna all’inizio


Lupus Eritematoso Sistemico
Lupus
Informazioni cliniche: il Lupus Eritematoso Sistemico (LES) è una malattia autoimmune sistemica appartenente al gruppo delle collagenosi. La diagnosi è basata su 11 criteri definiti dall’American College of Rheumatology (ACR) e modificati nel 1997. Se 4 degli 11 criteri sono presenti, la probabilità di LES è compresa tra l’80 e il 90%.

Gli anticorpi anti-dsDNA sono l’obiettivo principale nella diagnosi sierologica di LES. Questi anticorpi possono essere evidenziati nel 60 – 90% dei pazienti in base all’attività della malattia. In rari casi, gli anticorpi anti-dsDNA possono essere presenti sia in pazienti con altre malattie autoimmuni (per esempio epatite autoimmune) o infettive, che in persone clinicamente in buona salute. L’85% della popolazione appartenente a quest’ultimo gruppo sviluppa la patologia entro i 5 anni dalla determinazione degli anticorpi anti-dsDNA. Tuttavia, se gli anticorpi anti-dsDNA non sono individuati, non si può escludere il LES.

Ulteriori marker specifici per il LES sono gli anticorpi anti nucleosomi purchè siano determinati con un sistema di test avanzato che utilizza un antigene target purificato dagli istoni H1, Scl-70 e da altre proteine non istoniche.

Diagnostica: le diverse metodologie di test disponibili per la rilevazione sistematica degli autoanticorpi anti-dsDNA sono: ELISA, EUROASSAY, EUROLINE, RIA e l’immunofluorescenza su substrato Crithidia luciliae.

EUROIMMUN ha messo a punto un nuovo test: l’ELISA Anti-dsDNA-NcX, che supera di gran lunga le caratteristiche di qualità diagnostiche del convenzionale test ELISA anti-dsDNA. Il segreto dell’innovazione è l’utilizzo di nucleosomi altamente purificati come siti di legame.

Crithidia
Poiché i nucleosomi hanno una forte abilità adesiva, anche la più piccola concentrazione di questi è particolarmente adatta a legarsi al dsDNA isolato alla superficie della micropiastra. La Poli-L-lisina ed il solfato di protamina sono ormai obsoleti e molti falsi positivi possono essere evitati. In uno studio comparativo clinico su 378 pazienti affetti da malattie reumatiche (di cui 209 con LES), il test ELISA Anti-dsDNA-NcX ha dato una sensibilità più alta dell’8% rispetto al RIA anti-dsDNA, dimostrando così le sue ottime qualità diagnostiche.
OVERVIEW PRODOTTI
Torna all’inizio


Vasculiti
Vasuliti
Informazioni cliniche: secondo il sistema di classificazione introdotto alla Chapel Hill Consensus Conference, appartengono alle vasculiti ANCA associate (AAV): la granulomatosi di Wegener (WG, anche granulomatosi con poliangite, GPA), la poliangioite microscopica (MPA), la vasculite renale e la sindrome di Churg-Strauss. Gli ANCA (anticorpi anti citoplasma dei neutrofili) sono autoanticorpi diretti contro antigeni presenti nei granuli citoplasmatici dei monociti neutrofili. Sono marker sierologici importanti per la diagnosi delle AAV.

Diagnostica: la diagnosi degli autoanticorpi anti granulociti neutrofili si basa prevalentemente sull’immunoflurescenza indiretta (IFA). Il substrato standard dell’immunofluorescenza è un mosaico BIOCHIP contenente granulociti umani fissati in etanolo e formaldeide ed insieme ad un BIOCHIP di HEp-2 e granulociti sedimentati diventa un test estremamente utile al fine di una diagnosi differenziale. La tecnica EUROPLUS permette la combinazione di substrati di coltura cellulare convenzionale con singoli antigeni definiti (PR3, MPO, GBM) in un unico pozzetto. Ciò semplifica considerevolmente l’interpretazione dei pattern in immunofluorescenza.
CANCA
La tecnica IFA permette la differenziazione di due tipi di ANCA: quello citoplasmico (cANCA), associato alla granulomatosi di Wegener e quasi sempre diretto contro la proteinasi 3 (PR3) e quello perinucleare (pANCA), che corrisponde ad un’ampia gamma di malattie che solitamente reagiscono bene alla terapia immunosopressiva. Gli antigeni target dei pANCA sono: mieloperossidasi (MPO), elastasi, lattoferrina, lisozima, catepsina G, beta-glucuronidasi, azurocidina, proteina di membrana 1 associata a lisosoma, alfa-enolasi ed altre.
La positività in immunofluorescenza deve essere confermata attraverso test mono specifici come il test ELISA anti-PR3 o anti-MPO. I test IFA ed ELISA dovrebbero essere eseguiti parallelamente, poiché la combinazione di entrambi fornisce le più alte specificità e sensibilità per la rilevazione degli ANCA.

Innovativo test ELISA anti-PR3 con antigene ricombinante: i pozzetti del test ELISA anti-PR3-hn-hr sono caratterizzati dalla presenza di un mix di PR3 ricombinante e nativo. Il test acquisisce una sensibilità significativamente più alta (94%) ed una specificità molto buona (99%) rispetto al test ELISA che utilizza esclusivamente l’antigene nativo (78% e 88%, rispettivamente). La significativa maggiore sensibilità del test ELISA anti-PR3-hn-hr e l’utilità nel monitoraggio terapeutico è stata descritta anche in bibliografia (Damoiseaux et al., Ann Rheum Dis 2009, 68 (2):228-233).
MPO è il principale antigene target dei pANCA ma non tutti risultano positivi al test ELISA anti-MPO. Nel caso di risultati in immunofluorescenza positivi, dubbi o non supportati dalla clinica, la determinazione attraverso antigeni target con un test ELISA è obbligatorio per la verifica e la differenziazione dei risultati, ad es. il test ELISA anti-MPO o il profilo ELISA ANCA con gli antigeni PR3, MPO, elastasi, la catepsina G, lisozima e lattoferrina.
I pANCA sono inoltre di grande importanza nella differenziazione delle malattie croniche infiammatorie intestinali (67% colite ulcerosa, 7% morbo di Crohn). La lattoferrina legante il DNA è stata identificata come il principale antigene target (Teegen et al. 2009).

OVERVIEW PRODOTTI
Torna all’inizio


Artrite reumatoide
ArtriteReumatoide
Informazioni cliniche: l’artrite reumatoide (AR) è una delle malattie autoimmuni più comuni e ne è affetta circa l’1% della popolazione mondiale. È caratterizzata dall’infiammazione della membrana sinoviale, che si diffonde simmetricamente dalle piccole alle grandi articolazioni. I sintomi iniziali comprendono gonfiore e dolore delle articolazioni della dita con annessa rigidità mattutina. La diagnosi precoce e l’inizio immediato della terapia adatta è necessaria per tenere la malattia sotto controllo.
Il test sierologico più comunemente eseguito nei casi sospetti di AR è stato per molto tempo la determinazione del fattore reumatoide (FR). Questi sono anticorpi (principalmente di classe IgM) che reagiscono con le globuline (IgG) e si presentano nel siero del 60 – 80% dei pazienti affetti da AR. Il FR è un indicatore sensibile ma non molto specifico per le AR, poiché si presenta anche in individui sani ed in pazienti con varie infezioni o affetti da altre malattie autoimmuni (per esempio Lupus Eritematoso Sistemico, sindrome di Sjögren, sclerodermia).

Il marker sierologico più importante per AR è l’autoanticorpo anti peptide citrullinato (CCP). Gli anticorpi anti-CCP sono principalmente di classe IgG ed hanno una specificità del 98% per AR. A causa della loro alta specificità sono migliori del fattore reumatoide per la diagnosi di AR. Gli anticorpi anti-CCP possiedono una specificità molto più alta di FR (anti-CCP: 97%, FR: 62%) con la stessa sensibilità (anti-CCP: 79%, FR: 78%). Si rilevano molto presto nel corso della malattia e hanno un alto valore predittivo. Gli anticorpi anti-CCP possono essere individuati nelle fasi iniziali della malattia nel 79% dei pazienti. I pazienti con anticorpi anti-CCP sviluppano danni alle articolazioni più severi rilevate dalla radiologia rispetto ai pazienti anti-CCP negativi.
La determinazione degli anticorpi anti-CCP è altamente consigliata per una diagnosi precoce di AR, cruciale per l’inizio immediato della terapia appropriata e la prevenzione di danni. Inoltre, permette la differenziazione da altre malattie reumatiche quali il lupus eritematoso sistemico, sindrome di Sjögren o polimiositi/dermatomiositi.

L’alfa-enolasi citrullinato è l’autoantigene di interesse in circa il 50% dei pazienti affetti da AR (Prof. Venables, Kennedy Institute of Rheumatology, Imperial College Londra). L’epitopo responsabile della reazione autoimmune è stato denominato “peptide 1 citrullinato di alfa-enolasi” (CEP-1). Mentre questo peptide è riscontrato nel 7 su 62% dei sieri di pazienti affetti da AR, esso è rilevato solo nel 2-3% dei sieri dei pannelli di controllo. Inoltre, gli autoanticorpi diretti contro CEP-1 (anti-CEP-1) sono associati ad un sottotipo di AR in cui gli “epitopi condivisi” HLA-DRB1 rappresentano i principali fattori di rischio (Mahdi et al. Nature Genetics 2009).
Poiché gli autoanticorpi anti-CEP-1 si dirigono contro l’antigene bersaglio che si manifesta nell’artrite reumatoide, la loro determinazione riveste un’importanza fondamentale per rispondere ai quesiti relativi alla causa e alla patogenesi della malattia. La determinazione degli anti-CEP-1 è altamente specifica per l’AR (specificità 97,6%). Vi sono indicazioni, seppur precoci, del fatto che questo nuovo marker potrà dare delle risposte importanti sul decorso della malattia e sul successo della terapia nel paziente, e che potrà contribuire a colmare il gap diagnostico per i pazienti che risultano negativi per gli anti-CCP2.

Diagnostica: l’anti-CCP dovrebbe essere individuato utilizzando esclusivamente il test ELISA contenente l’antigene CCP nativo (CCP, CCP2 di seconda generazione) descritto nelle molte pubblicazioni di Walter van Venrooij et al. Soltanto questo antigene possiede la sensibilità e la specificità ottimali descritte in numerosi studi internazionali.

OVERVIEW PRODOTTI
Torna all’inizio


Sidnrome da antifosfolipidi

APS
Informazioni cliniche: i primi criteri di classificazione ufficiale per la sindrome da antifosfolipidi (APS) sono stati enunciati nel 1998 durante un workshop all’ottavo “International Symposium on Anti-phosholipid Antibodies” tenutosi a Sapporo, Giappone (Sapporo criteria; Wilson et al., Arthritis & Rheumatism 1999). Secondo questi criteri, le APS possono essere diagnosticate se almeno un criterio clinico e uno sierologico vengono riscontrati. I criteri clinici comprendono la trombosi vascolare, che deve essere stabilita secondo i criteri indicati, le complicazioni in gravidanza quali le nascite premature, gli aborti spontanei e l’eclampsia.
Quando i criteri sono stati aggiornati nel 2004 (criteri di Miyakis; Miyakis et al., Journal of Thrombosis and Haemostasis 2005) sono stati aggiunti gli anticorpi anti-β2 glicoproteina 1. L’adempimento dei criteri ora comprende almeno uno di seguenti tre parametri: anticorpi anti cardiolipina (ACA; IgG o IgM), β2 glicoproteina 1 (anti-β2GP1; IgG o IgM) o un test positivo per il lupus anticoaugulante (LA). Conformemente alle raccomandazioni ufficiali i criteri sierologici per la diagnosi di APS sono soddisfatti solamente quando il risultato viene confermato 12 settimane dopo con un ulteriore test. Nel 2012, un aggiornamento ulteriore dei criteri di classificazione (Lakos et al., Arthritis & Rheumatism 2012) ha incluso la raccomandazione supplementare che quando i test per le IgM e le IgG per ACA o anti- β2GP1 IgG sono negativi, andrebbero testate pure le IgA.
Nella diagnosi sierologica delle APS, gli autoanticorpi di diverse classi di immunoglobuline (IgAGM) possono presentarsi simultaneamente, sebbene spesso soltanto una classe di Ig sia individuata. L’associazione di particolari classi di immunoglobuline (IgAGM) con parametri clinici particolari è ancora oggetto di controverse discussioni.
Dal momento che circa il 10% della popolazione sana ha anticorpi anti-fosfolipidi (APLA) nella forma di ACA o LA e questi anticorpi possono essere indotti anche da infezioni o farmaci specifici (per esempio procainamide ed idralazina), è importante collegare i risultati sierologici con i criteri clinici.

Diagnostica: la tecnica ELISA è il metodo per la determinazione degli APLA, poiché è altamente sensibile, semplice da eseguire e non richiede il plasma fresco. EUROIMMUN offre micropiastre ELISA per la determinazione quantitativa degli autoanticorpi anti cardiolipina, β2 2GP1 e la fosfatidilserina. Le classi di immunoglobulina IgA, IgG e IgM possono essere determinate esclusivamente o insieme (IgAGM). In alternativa, il lupus anticoaugulante può essere determinato facendo uso di una procedura a più fasi secondo le linee guida della International Society on Thrombosis and Haemostasis. I test di coagulazione di fosfolipidi-dipendenti utilizzati per questo scopo hanno un’alta specificità per APS, ma una bassa sensibilità. Inoltre, dal momento che non c’è un gold standard, i risultati variano in base alla metodologia usata, rendendo difficile ottenere risultati sierologici affidabili.
I test EUROIMMUN ELISA per la rilevazione degli anticorpi anti cardiolipina e β2GP1 mostrano una specificità molto alta negli studi clinici. I sieri dei pazienti affetti da parvovirus B19 o da epatite virale e sieri di donatori in buono stato di salute hanno dimostrato risultati positivi compresi tra 0 – 2%, mentre in studi dove sono stati utilizzati prodotti di altre aziende sono stati ottenuti valori compresi tra il 12-50%.
APLA può verificarsi in casi di sifilide, che spiega in qualche modo l’alta occorrenza (11 – 13%) degli anticorpi ACA e anti- β2GP1 in questi pazienti. La prevalenza sia degli autoanticorpi in APS (86%) che di SLE (24 – 25%) corrisponde ai dati presenti in letteratura. Per ACA in particolare è stato trovato un accordo con uno studio internazionale (corte di 1000 pazienti, 88% dei pazienti affetti da APS era positivo agli ACA; Cervera R. et al., Arthritis & Rheumatism 2002).

OVERVIEW PRODOTTI
Torna all’inizio